Influencia de la rutina y su combinación con metformina sobre las funciones vasculares en la diabetes tipo 1

Scientific Reports volumen 13, número de artículo: 12423 (2023) Citar este artículo

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El presente trabajo examinó el efecto de la administración oral de rutina y su combinación con metformina, un fármaco antidiabético, sobre la glucosa en sangre, el nivel de colesterol total y triglicéridos y la función vascular en ratas con diabetes inducida por estreptozotocina (STZ). Ratas macho Sprague Dawley se volvieron diabéticas mediante una única inyección intraperitoneal de STZ (50 mg/kg). Se administraron por vía oral rutina y metformina a ratas diabéticas en dosis de 100 mg/kg y 300 mg/kg de peso corporal/día, respectivamente, durante 4 semanas. Se realizaron análisis de plasma para determinar cambios en los niveles de glucosa y lípidos en plasma. Se registró la reactividad del anillo aórtico de rata en respuesta a relajantes dependientes del endotelio (acetilcolina, ACh) e independientes del endotelio (nitroprusiato de sodio, SNP), y al agonista adrenérgico α1 fenilefrina (PE). Se evaluó la histología de páncreas, hígado y riñón. En los resultados, la rutina y la metformina solas y en combinación han dado lugar a mejoras significativas en los niveles de glucosa, colesterol y triglicéridos en sangre en comparación con el grupo de diabéticos. Los anillos aórticos diabéticos mostraron una contracción significativamente mayor en respuesta a la PE y menos relajación en respuesta a la ACh y el SNP. El tratamiento con rutina y metformina en combinación redujo significativamente la contracción inducida por PE y aumentó la relajación inducida por ACh y SNP en la diabetes en comparación con la rutina o metformina solas. Se observaron mejoras histológicas significativas con la terapia combinada. En conclusión, la terapia combinada de rutina y metformina tiene la mayor potencialidad para restaurar los niveles de glucosa y lípidos en sangre, así como la función vascular.

En 2021, aproximadamente 8,4 millones de personas tenían diabetes tipo 1 en todo el mundo, y se espera que esta cifra aumente a 17,4 millones para 20401. La diabetes tipo 1 con hiperglucemia es el resultado de la falta de insulina secretada por las células β pancreáticas, que son destruido por el sistema inmunológico por la alteración de la función endotelial a través del estrés oxidativo2. Las evidencias han demostrado que el estrés oxidativo ha sido reconocido como el factor clave que inicia las diversas vías del daño hiperglucémico3. La consecuencia de estas vías eventualmente conduce al aumento de ROS, lo que disminuye aún más la producción de NO o mejora su degradación4. Un metaanálisis reciente mostró que los niños y adultos con diabetes tipo 1 tienen signos de disfunción endotelial vascular grande que los predispone a muchas complicaciones vasculares como retinopatía diabética, nefropatía, neuropatía y enfermedades cardiovasculares5. En general, esto genera discapacidad y una menor esperanza de vida, además de enormes costes sanitarios para la sociedad2.

En las últimas décadas, la investigación sobre intervenciones terapéuticas para el tratamiento de la diabetes tipo 1 ha aumentado enormemente2,6. Sin embargo, los pacientes que dependen de la insulina todavía buscan una terapia curativa eficaz para mitigar la hiperglucemia. Varios estudios han demostrado que la metformina tiene un mayor potencial para reducir los criterios de valoración relacionados con la diabetes en comparación con otros fármacos antidiabéticos como la clorpropamida, la glibenclamida o la insulina7. Además de esto, los estudios han documentado el uso de metformina con otros agentes hipoglucemiantes como insulina y sulfonilureas para mejorar el perfil diabético general en pacientes con diabetes tipo 18,9,10. Además, a la metformina se le han atribuido características vasculoprotectoras directas7.

Teniendo en cuenta los efectos adversos y la falta de eficacia de la actual terapia con insulina, ha habido un aumento en la búsqueda de otros posibles hipoglucemiantes orales o productos naturales más seguros para la prevención de la diabetes tipo 1. La rutina es un flavonoide muy conocido que se encuentra en abundancia en las cebollas, las manzanas, el té y el vino tinto y que tiene muchas propiedades farmacológicas potenciales, incluidos efectos antidiabéticos y vasorelajantes11. Se ha observado que la rutina reduce el estrés oxidativo que está predominantemente implicado en la patogénesis de la diabetes tipo 1 y sus complicaciones12.

Además, las propiedades antioxidantes de la rutina han llamado la atención debido a su potencial como tratamiento alternativo para mitigar eficazmente diversas disfunciones metabólicas y vasculares12. Además, los efectos combinados de la rutina y la metformina en el contexto del control de la diabetes y la función vascular no se han investigado exhaustivamente. Por lo tanto, el propósito de este estudio fue evaluar los efectos de la administración oral de rutina, metformina y su combinación sobre los niveles de glucosa en sangre, colesterol total y triglicéridos, así como la función vascular en ratas diabéticas inducidas por estreptozotocina (STZ). Nuestro objetivo fue evaluar los posibles efectos sinérgicos de la rutina y la metformina para restaurar los parámetros metabólicos y mejorar la función vascular. También se realizaron evaluaciones histológicas del páncreas, el hígado y el riñón para evaluar las mejoras histológicas asociadas con los tratamientos. Comprender el impacto de la rutina, la metformina y su combinación en el control de la glucosa en sangre, los perfiles de lípidos y la función vascular podría proporcionar información valiosa sobre su potencial terapéutico para controlar las complicaciones relacionadas con la diabetes. En general, este estudio proporciona una mejor comprensión de los efectos antidiabéticos de la rutina cuando se consume individualmente y concomitantemente con metformina.

El valor medio de glucosa en sangre fue significativamente (p < 0,01) menor en ratas diabéticas tratadas con rutina (16,1 ± 0,6 mmol/l) y metformina (14,5 ± 1,0 mmol/l) en comparación con las ratas diabéticas del grupo control (26,6 ± 2,1 mmol/l). l). Sin embargo, la terapia combinada de rutina y metformina pareció sobresalir en el efecto hipoglucemiante en comparación con los tratamientos individuales (11,5 ± 1,1 mmol/l, p < 0,01) (Tabla 1).

El nivel medio de colesterol total fue significativamente mayor (p <0,01) en el grupo de control diabético en comparación con el grupo de control normal. Después del tratamiento con rutina sola (1,48 ± 0,27 mmol/l) o en combinación con metformina (1,40 ± 0,43 mmol/l), el nivel de colesterol total disminuyó significativamente (p < 0,01) en comparación con el control diabético (3,00 ± 0,30 mmol/l). ), a un nivel comparable al control normal (1,49 ± 0,45 mmol/l). Los niveles de colesterol total en el grupo tratado con metformina (2,23 ± 0,86 mmol/l) y en el grupo de control diabético se mantuvieron sin cambios (p > 0,05) (Tabla 1). La diabetes inducida por STZ (4,57 ± 2,5 mmol/l) produjo un aumento significativo (p < 0,01) en el nivel de triglicéridos totales que el grupo de control normal (1,33 ± 0,4 mmol/l). Pero el tratamiento con rutina (1,59 ± 0,5 mmol/l) o metformina (1,09 ± 0,2 mmol/l) y en combinación (1,42 ± 0,4 mmol/l), disminuyó significativamente el nivel de triglicéridos totales (p < 0,01) en comparación con el paciente diabético. grupo control (4,57 ± 2,5 mmol/l) (Tabla 1).

La vasoconstricción de los tejidos endoteliales intactos con PE en la concentración más alta probada (10-2) aumentó significativamente (p <0,01) en los anillos aórticos abdominales de ratas diabéticas en comparación con los anillos aórticos abdominales tomados de ratas normales con (Fig. 1a). El tratamiento con rutina sola demostró una reducción significativa (p < 0,01) en el porcentaje de contracción con la concentración más alta de PE en comparación con los anillos aórticos para diabéticos. Sin embargo, el tratamiento con metformina sola y junto con rutina redujo notablemente las respuestas a la PE en concentraciones de 10-4, 10-3 y 10-2 en comparación con el tratamiento con rutina y el control normal y diabético (p <0,01). En general, las ratas diabéticas tratadas con metformina y rutina exhiben la menor cantidad de contracción en respuesta a la PE.

Curvas de concentración-efecto acumuladas que muestran respuestas contráctiles al agonista de los receptores adrenérgicos α1 fenilefrina (PE) del endotelio intacto (+ ED), (a) anillos de aorta abdominal, (b) anillos de aorta torácica. Rutina (100 mg/kg), metformina (300 mg/kg). Los símbolos representan medias ± DE. # denota p < 0,05 frente a la respuesta en anillos aórticos de ratas normales tratados con vehículo; ## denota p < 0,01 frente a la respuesta en anillos aórticos de ratas normales tratados con vehículo; ** denota p < 0,01 frente a la respuesta en anillos aórticos de ratas diabéticas tratadas con vehículo; $$ denota p < 0,01 frente a la respuesta en anillos aórticos de ratas diabéticas tratadas con rutina; ^ denota p <0,05 frente a la respuesta en anillos aórticos de ratas diabéticas tratados con metformina.

La vasoconstricción de PE en concentraciones de 10-3 y 10-2 aumentó significativamente (p <0,01) en los anillos de la aorta torácica de ratas diabéticas en comparación con los anillos de la aorta torácica tomados de ratas normales (Fig. 1b). El tratamiento con rutina o metformina ha demostrado una reducción significativa (p < 0,01) en el porcentaje de contracción a 2 de la concentración más alta de PE en comparación con los anillos aórticos para diabéticos. Sin embargo, el tratamiento con metformina y rutina mostró la reducción más significativa (p <0,01) en la respuesta a la PE en concentraciones de 10-3 y 10-2 en comparación con el control diabético. El porcentaje de contracción máximo de la combinación de rutina con metformina en respuesta a PE 10-2 parece ser significativamente (p <0,01) más eficaz que el control normal. Además de esto, también se encontró que el efecto de la terapia combinada era significativamente mejor en la concentración más alta en comparación con el tratamiento de rutina y el tratamiento con metformina solos.

La contracción del tejido en respuesta a la PE en los anillos aórticos abdominales desprovistos de endotelio de ratas tratadas con STZ aumentó significativamente en comparación con las ratas normales con concentraciones de PE de 10-3 y 10-2 (Fig. 2a). Los anillos aórticos de aquellos tratados con rutina o metformina y en combinación también mostraron una reducción significativa en la contracción máxima a PE (p <0,01), pero la rutina y metformina en combinación exhibieron la mayor reducción en la contracción máxima, a un nivel de contracción inducida por PE que fue significativamente (p < 0,01) menor que el control normal y el grupo tratado con rutina.

Curvas de concentración-efecto acumuladas que muestran respuestas contráctiles al agonista de los receptores adrenérgicos α1 fenilefrina (PE) en endotelio desnudo (-ED), (a) anillos de aorta abdominal, (b) anillos de aorta torácica. Rutina (100 mg/kg), metformina (300 mg/kg). Los símbolos representan medias ± DE. # denota p < 0,05 y ## denota p < 0,01 frente a la respuesta en anillos aórticos de rata normal tratados con vehículo; * denota p < 0,05 y ** denota p < 0,01 frente a la respuesta en anillos aórticos de ratas diabéticas tratadas con vehículo. $$ denota p <0,01 frente a la respuesta en anillos aórticos de ratas diabéticas tratadas con rutina.

La Figura 2b muestra el gráfico de las respuestas a la EP de la aorta torácica sin endotelio de todos los grupos de tratamiento. Aunque los anillos aórticos para diabéticos no mejoraron significativamente la contracción del tejido en respuesta a la PE en comparación con el control normal. Los anillos aórticos de los tratados con rutina o metformina y en combinación mostraron una reducción significativa (p < 0,05 y 0,01) en la contracción máxima de PE en comparación con el control diabético y normal. Además, la rutina y la metformina en combinación exhibieron el porcentaje más bajo de contracción en una concentración de PE de 10-2.

Los anillos aórticos se contrajeron previamente con una concentración submáxima de PE (10 µM) y posteriormente se agregaron concentraciones crecientes de ACh (1 nM a 1 µM) para relajar la aorta precontraída. La Figura 3a muestra las curvas de respuesta a la dosis de ACh de tejidos endoteliales intactos de la aorta abdominal. A partir de la curva, se puede entender que la relajación mediada por ACh se redujo significativamente en los anillos aórticos de ratas diabéticas en comparación con los anillos aórticos no diabéticos con concentraciones de ACh de 10-4, 10-3 y 10-2. El tratamiento con rutina tuvo un efecto significativo sobre las respuestas vasorelajantes a la ACh en concentraciones de 10-3 y 10-2 en comparación con el control diabético, pero el tratamiento con metformina sola y en combinación con rutina mostró un efecto vasorelajante completamente normalizado a una concentración similar de ACh en comparación. a los grupos de diabéticos y tratados con rutina (p < 0,01), lo que denota efectos más potentes.

Curvas de concentración-efecto acumuladas que muestran respuestas de relajación dependientes del endotelio a la acetilcolina (ACh) en endotelio intacto (+ ED), (a) anillos de aorta abdominal, (b) anillos de aorta torácica. Rutina (100 mg/kg), metformina (300 mg/kg). Los símbolos representan medias ± DE. # denota p < 0,05 y ## denota p < 0,01 frente a la respuesta en anillos aórticos de rata normal tratados con vehículo; * denota p < 0,05 y ** denota p < 0,01 frente a la respuesta en anillos aórticos de ratas diabéticas tratadas con vehículo; $$ denota p < 0,01 y $ denota p < 0,05 frente a la respuesta en anillos aórticos de ratas diabéticas tratadas con rutina; ^ denota p <0,05 frente a la respuesta en anillos aórticos de ratas diabéticas tratados con metformina.

Las curvas de respuesta a la dosis de ACh de tejidos con endotelio intacto de la aorta torácica mostraron que había un desplazamiento hacia la derecha en la curva de respuesta a la concentración de ACh en los anillos aórticos de ratas diabéticas, lo que indica que la relajación mediada por ACh se redujo significativamente en los anillos aórticos de ratas diabéticas en comparación con los anillos no aórticos. anillos aórticos diabéticos en la mayoría de las concentraciones de ACh (Fig. 3b). El tratamiento con rutina o metformina y en combinación mostró una mejora significativa en la vasorelajación inducida por ACh a concentraciones de ACh de 10-3 y 10-2, pero aún se mantuvo significativamente más alta que el control normal. Sin embargo, el grupo tratado con rutina más metformina mostró la reducción más significativa (p <0,05) en la relajación máxima inducida por ACh en una concentración de 10-2 en comparación con los grupos de tratamiento con rutina o metformina. Para comparar, en general, el grupo tratado con rutina mostró una curva de línea más deprimida con una mejora más significativa (p <0,01) de las respuestas vasorelajantes a la ACh en ciertas concentraciones (10-7, 10-6, 10-4, 10-3) que la metformina. grupo tratado, lo que indica que la rutina tuvo un mayor efecto vasorelajante en comparación con la metformina, aunque no significativo. Sin embargo, se encontró que la curva lineal del grupo de tratamiento con rutina más metformina estaba más deprimida que el resto, excepto el control normal, lo que indica que el tratamiento combinado causó la corrección más significativa de la reducción de la relajación inducida por ACh en la aorta diabética en la mayoría de las concentraciones, a pesar de que el efecto máximo sigue siendo mayor que el control normal.

Se aplicaron concentraciones crecientes de SNP (1 nM a 1 µM) a los anillos aórticos precontraídos de PE (10 µM) para determinar la curva de respuesta a la concentración de SNP (Fig. 4a). La prueba post hoc de Tukey no mostró diferencias estadísticas entre todos los grupos de tratamiento en la aorta abdominal.

Curvas de concentración-efecto acumuladas que muestran respuestas de relajación endotelial independiente al nitroprusiato de sodio (SNP) en endotelio intacto (+ ED), (a) anillos de aorta abdominal, (b) anillos de aorta torácica. Rutina (100 mg/kg), metformina (300 mg/kg). Los símbolos representan medias ± DE. ## denota p < 0,01 frente a la respuesta en anillos aórticos de ratas normales tratados con vehículo; ** denota p < 0,01 frente a la respuesta en anillos aórticos de ratas diabéticas tratadas con vehículo; $$ denota p <0,01 frente a la respuesta en anillos aórticos de ratas diabéticas tratadas con rutina.

La Figura 4b muestra el resultado de las relajaciones inducidas por SNP en los anillos de la aorta torácica de los distintos grupos experimentales. Las curvas de relajación para SNP para los distintos grupos fueron similares, aparte de una reducción significativa en la relajación máxima registrada para los anillos diabéticos de control en comparación con el anillo aórtico de control normal (p <0,01) y mejoras significativas en la relajación máxima inducida por SNP. encontrado tanto para el grupo de rutina como para el de rutina más metformina en comparación con el anillo aórtico de control para diabéticos (p <0,05).

Los anillos aórticos abdominales desnudos del endotelio diabético mostraron una relajación independiente del endotelio significativamente reducida (p <0,05 y 0,01) en la concentración de SNP de 10-4, 10-3 y 10-2 (Fig. 5a). El tratamiento de ratas diabéticas con rutina más metformina mostró una respuesta significativamente mejor (p <0,05) al SNP en concentraciones de 10-3 y 10-2 en comparación con los anillos aórticos para diabéticos. Sin embargo, el tratamiento con rutina y metformina individualmente no afectó significativamente la respuesta aórtica al SNP.

Curvas acumuladas de concentración-efecto que muestran respuestas de relajación endotelial independiente al nitroprusiato de sodio (SNP) en endotelio desnudo (-ED), (a) anillos de aorta abdominal, (b) anillos de aorta torácica. Rutina (100 mg/kg), metformina (300 mg/kg). Los símbolos representan medias ± DE. # denota p < 0,05 y ## denota p < 0,01 frente a la respuesta en anillos aórticos de rata normal tratados con vehículo; * denota p < 0,05 y ** denota p < 0,01 frente a la respuesta en anillos aórticos de ratas diabéticas tratadas con vehículo.

Los anillos aórticos torácicos desnudos del endotelio diabético mostraron una relajación independiente del endotelio significativamente reducida (p <0,05 y 0,01) en concentraciones de SNP de 10-5, 10-4 y 10-3 (Fig. 5b). El tratamiento de ratas diabéticas con rutina y metformina individualmente solo mostró una respuesta significativamente mejor al SNP en concentraciones de 10-5 y 10-4 en comparación con los anillos aórticos para diabéticos. Sin embargo, la relajación máxima a una concentración de 10-2 de SNP mejoró en el grupo tratado con rutina (p <0,01).

Las ratas del grupo de control normal mostraron una arquitectura normal en los tres órganos, como el páncreas (ácinos exocrinos e islotes normales con celularidad y distribución adecuada), el hígado (hepatocitos y sinusoides normales, arquitectura normal de la vena central junto con tríadas portales bien espaciadas, sin evidencia de congestión) y riñones (glomérulos, túbulos e intersticio normales) (Fig. 6a). Mientras que las ratas del grupo de control de la diabetes mostraron páncreas dañados con sistemas endocrinos y exocrinos difusos. Los acinos aparecieron necróticos en áreas focales y los islotes endocrinos mostraron una reducción en tamaño, número de células y distribución (Fig. 6b). El hígado y los riñones parecían normales (Fig. 6b).

El efecto de los compuestos sobre el páncreas, el hígado y los riñones. Rutina (100 mg/kg). Metformina (300 mg/kg). Aumento de 100 ×. IL: Islotes de Langerhans. R: Acinos. H: Hepatocitos. S: Sinusoides. V: Vena Central. PT: Tríada Portal. B: espacio de Bowman. G: glomérulo. T: túbulos renales.

Las ratas alimentadas con rutina mostraron signos de recuperación del páncreas como acinos normales observados en la periferia de las áreas exocrinas (Fig. 6c). Sin embargo, no hubo mucha proliferación significativa de los islotes en términos de distribución, número y celularidad. El hígado y el riñón mostraron morfología normal. No hubo congestión en la vena central ni en las tríadas portales y los glomérulos eran normocelulares (Fig. 6c). En el grupo de tratamiento con metformina, el páncreas mostró pocas áreas residuales de daño mezcladas con abundantes áreas de acinos en regeneración y una buena distribución de islotes con celularidad saludable (Fig. 6d). El hígado y el riñón mostraron una arquitectura normal (Fig. 6d). La combinación de rutina y metformina dio como resultado una arquitectura normal del páncreas con islotes endocrinos (Fig. 6e). La distribución de los islotes estaba adecuadamente espaciada. La celularidad en los islotes fue buena, con algunos islotes más grandes que el grupo normal. El hígado y el riñón mostraron una arquitectura normal (Fig. 6e).

Los análisis de plasma revelaron que los niveles elevados de glucosa en ratas diabéticas se redujeron significativamente cuando se suplementaron con rutina o metformina y una combinación de ambas. Estos resultados corroboraron bien los efectos hipoglucemiantes de la metformina13 o la rutina14,15. Se ha informado que se cree que el efecto hipoglucemiante de la rutina está mediado por (a) el aumento de la secreción de insulina, (b) la afinidad de unión a la insulina, (c) el consumo periférico de glucosa, (d) la disminución de la absorción intestinal de glucosa y colesterol, y (e) disminución de la actividad de las enzimas gluconeogénicas y glucogenolíticas16. Además de esto, también se propuso que el efecto beneficioso de la rutina sobre el perfil glucémico se debía a su efecto protector sobre las células β pancreáticas que preservaban la capacidad secretora de insulina, potenciando así la secreción de insulina y el efecto reductor de la glucosa17. De manera similar, se sabe que la metformina mejora la captación de glucosa en el músculo esquelético y suprime la secreción de glucosa en el hígado18. Sin embargo, el mecanismo exacto de la reducción de la glucosa aún no está claro2. En general, la combinación de metformina y rutina mostró efectos reductores de glucosa en sangre más significativos en ratas diabéticas.

El metabolismo de los lípidos comúnmente está alterado en condiciones diabéticas debido a la falta de insulina para regular la síntesis y descomposición de los lípidos en los tejidos adiposos, causando así dislipidemia que conduce a la aterosclerosis19. En vista del perfil lipídico, las ratas diabéticas exhibieron una marcada elevación del colesterol total en suero y del nivel de triglicéridos totales. El tratamiento de ratas diabéticas STZ con metformina redujo significativamente los triglicéridos totales, excepto el colesterol. Estos resultados están en congruencia con Sin et al.20, quienes demostraron una mejora significativa en el nivel de triglicéridos después del tratamiento con metformina en pacientes con diabetes tipo 2. Por el contrario, una revisión sistémica y un metanálisis de ensayos clínicos controlados aleatorios sugirieron que la metformina no tenía ningún efecto intrínseco sobre el nivel de triglicéridos séricos, pero reducía significativamente el colesterol total en pacientes con diabetes tipo 221.

Por otro lado, el tratamiento de rutina en ratas diabéticas tuvo un efecto más potente en la disminución del colesterol total y menos efectivo en la disminución de los triglicéridos en comparación con el grupo alimentado con metformina. Estos resultados concuerdan con los de Ahmed et al.16, quienes demostraron un alivio mediado por la rutina de los lípidos séricos totales, el colesterol y los triglicéridos en ratas diabéticas. La capacidad de la rutina para reducir el colesterol y los triglicéridos podría explicarse por la capacidad liberadora de insulina, la afinidad de unión a la insulina, la disminución de la absorción intestinal de colesterol y la inactivación de la HMG-CoA16 hepática. En general, el tratamiento con rutina y metformina ejerció el mayor efecto hipolipidémico en comparación con sus homólogos individuales.

Este estudio demostró que después de 8 semanas de diabetes, la disfunción endotelial era evidente en la aorta de rata diabética. Se observó que, en comparación con los anillos aórticos de ratas normales, las contracciones agonistas del receptor α1 inducidas por PE aumentaron en los anillos aórticos endoteliales intactos de ratas diabéticas, mientras que la relajación dependiente del endotelio inducida por ACh se mitigó en los anillos aórticos diabéticos. Estos datos son consistentes con informes anteriores que muestran contracciones mejoradas en respuesta al estimulante adrenérgico α1 PE y relajación reducida en respuesta al vasodilatador endotelial dependiente ACh en preparaciones vasculares de animales diabéticos22. Se han implicado múltiples mecanismos en caso de disfunción endotelial en respuesta a niveles elevados (agudos o prolongados) de glucosa en sangre, pero el aumento del estrés oxidativo parece ser la primera alteración que desencadena otras23. El deterioro de la función vascular en los anillos aórticos diabéticos observado en este estudio podría atribuirse al aumento de la producción de aniones superóxido en presencia de hiperglucemia.

La relajación inducida por SNP no se redujo significativamente en los anillos endoteliales intactos de diabéticos, excepto en la concentración más alta de SNP en la aorta torácica. Mientras que en el caso de los vasos sin endotelio, la relajación inducida por SNP se redujo significativamente en la aorta abdominal y torácica en diversas concentraciones. Este ha sido un hallazgo raro ya que no se había informado previamente en sujetos diabéticos. Por lo tanto, los resultados de este estudio concuerdan y contrastan con los resultados de estudios vasculares previos realizados en ratas diabéticas inducidas por STZ en las que la respuesta al SNP no difirió entre normales y diabéticos, aunque dicha diferencia no fue excluida24. Sartoretto y colaboradores25 informaron una respuesta aórtica diabética alterada tanto a la ACh como al SNP, mientras que Calver et al.26 demostraron que la respuesta al SNP fue significativamente menor en los diabéticos en comparación con los controles sanos, sin cambios significativos en la respuesta vascular a Relajación inducida por ACh. Por lo tanto, la respuesta vasodilatadora atenuada a los reactivos independientes del endotelio sugirió que el endotelio disfuncional no era el único responsable de la relajación vascular alterada observada en sujetos diabéticos. Una respuesta dilatadora alterada al SNP puede deberse a múltiples anomalías y algunas de ellas se han asociado con disfunción del músculo liso como consecuencia de la diabetes27. Se ha postulado que dicho defecto podría atribuirse a la disminución de la biodisponibilidad de SNP/NO o a la disminución de la sensibilidad o capacidad de respuesta al NO.

En este estudio, encontramos que la metformina, sola, redujo la contracción inducida por el estimulante adrenérgico α1, aumentó la relajación endotelial dependiente de ACh y la relajación endotelial independiente inducida por SNP en anillos aórticos de ratas diabéticas. Este hallazgo es consistente con estudios previos que informaron que la metformina provocó efectos vasodilatadores no solo en aortas aisladas de ratas diabéticas inducidas por STZ25,28 sino también en humanos29. Majithiya y colaboradores encontraron que la mejora en la función vascular puede deberse a la participación de la vía del NO y el GMPc, ya que demostraron que la relajación mejorada inducida por la ACh en ratas diabéticas con STZ tratadas con metformina se bloqueaba en presencia de N ( éster metílico de gamma)-nitro-L-arginina (L-NAME) y bloqueador de cGMP, pero no en presencia de indometacina. De hecho, los estudios que investigan los niveles de nitrito aórtico como índice de generación de NO han demostrado que el tratamiento con metformina aumentó significativamente la biodisponibilidad de NO en las aortas de ratas con diabetes STZ y, por lo tanto, mejoró la función endotelial29.

El tratamiento de ratas diabéticas con metformina tampoco mostró una mejora significativa en la vasorelajación endotelial independiente en el endotelio intacto de la aorta abdominal y torácica. También se observaron efectos similares en ambas regiones de la aorta endotelial desnuda, excepto en la aorta torácica, en una concentración moderada de SNP. Por lo tanto, esto es parcialmente consistente con varios estudios que afirmaron una diferencia no significativa en la relajación dependiente de la concentración inducida por SNP en el tratamiento con metformina en anillos aórticos diabéticos28.

Además de la metformina, el tratamiento de rutina también atenuó las contracciones inducidas por PE en los anillos aórticos intactos y desnudos del endotelio y aumentó la relajación inducida por ACh en los anillos aórticos de ratas diabéticas, observándose mayores efectos en las aortas torácicas en comparación con la metformina. El efecto vasorelajante inducido por la rutina ha sido descrito previamente por Fusi et al30. Se ha sugerido que la rutina parecía depender de la vía NO/guanilato ciclasa31. La preservación de la actividad del NO puede deberse a la capacidad de la rutina para preservar la integridad de las células endoteliales, ya que se descubrió que la rutina previene la toxicidad endotelial y la apoptosis al inhibir la acumulación de oxidante intracelular32.

En cuanto al caso de los vasos denudados del endotelio, la constricción aórtica observada en respuesta a la EP aumentó en la aorta abdominal diabética. El tratamiento con rutina y metformina, ya sea individualmente o en combinación, redujo la respuesta vasoconstrictora a la PE en altas concentraciones. Esto muestra que la diabetes también puede causar disfunción en la capa de células del músculo liso para producir un control ineficaz de la función vascular27. Tanto la rutina como la metformina no sólo actúan sobre el endotelio sino también sobre la capa de células del músculo liso para producir una menor respuesta contráctil a la PE. También se pueden encontrar efectos similares en la aorta torácica, aunque con un efecto menos notorio.

Como se mencionó anteriormente, la relajación inducida por SNP en los anillos de la aorta torácica y abdominal sin endotelio mostró que el tejido diabético ejerce significativamente menos vasorelajación en comparación con el control normal a cierta concentración, pero el tratamiento con rutina más metformina revirtió significativamente ese efecto, mientras que los tratamientos individuales con rutina y metformina lo hicieron. no muestran ninguna diferencia significativa en la respuesta en la aorta abdominal, pero se encontró una reducción significativa de la relajación inducida por SNP en la aorta abdominal; comprobando así su efecto sinérgico.

En la evaluación de la función vascular, aunque las monoterapias con rutina y metformina mostraron una mejoría respecto al deterioro de la función vascular en la diabetes, la terapia combinada de ambos fármacos mostró el mayor avance en el resultado del experimento vascular. Hasta donde sabemos, este es el primer informe que muestra los efectos beneficiosos de la rutina y la metformina en combinación sobre la función vascular en la diabetes. La terapia combinada de rutina y metformina mostró un efecto vasorelajante significativamente más fuerte que la monoterapia, ya que no solo atenuó las contracciones inducidas por PE en los anillos diabéticos, sino que también mejoró la relajación de la ACh y del SNP. Sin embargo, aún no se ha establecido el mecanismo de acción de esta marcada mejora de la función vascular en el grupo combinado. Las razones de este efecto sinérgico de la terapia con rutina y metformina pueden estar relacionadas con los potentes efectos beneficiosos de la rutina y la metformina individualmente y con el hecho de que ambas comparten vías similares, que es la vía NO/guanilato ciclasa para mejorar la función endotelial. Sin embargo, existe la posibilidad de que otras vías puedan actuar de manera similar o por separado entre las dos y que coincidan para provocar un efecto sinérgico general sobre la función vascular. Además, los resultados obtenidos con el análisis histológico son coincidentes con los demás resultados de este estudio.

En conclusión, el presente estudio demuestra que el tratamiento combinado de rutina y metformina en concentraciones de rutina de 100 mg/kg y metformina de 300 mg/kg parecía ser una buena dosis con efectos favorables tanto en el perfil bioquímico como en la función vascular. Estos resultados aumentan la potencialidad de la combinación de rutina y metformina como tratamientos valiosos para mejorar la función vascular en la diabetes tipo 1.

El hidrato de rutina, el clorhidrato de fenilefrina (PE), el cloruro de acetilcolina (ACh), el nitroprusiato de sodio (SNP), la estreptozotocina (STZ), la metformina y las sales de Krebs se adquirieron de Sigma Chemicals Company (St. Louis, MO, EE. UU.).

Se obtuvieron de la Universidad de Putra Malasia (UPM) treinta ratas macho Sprague-Dawley de entre 10 y 14 semanas de edad con un peso corporal de entre 150 y 200 g. Todos los animales se alojaron en las instalaciones departamentales de retención de animales de la Universidad Médica Internacional (IMU) en condiciones controladas (21–24 °C con ciclos de 12 h de luz y 12 h de oscuridad). Los animales tuvieron libre acceso a comida para ratas estándar y agua de ósmosis inversa durante todo el experimento, excepto cuando se indicara lo contrario. La aprobación de los estudios se obtuvo del Comité Conjunto de Ética, IMU, Kuala Lumpur, Malasia, con el número de aprobación: BMS/I-02/2012(01). Los experimentos y procedimientos con animales se llevaron a cabo de acuerdo con las pautas de cuidado ético y las regulaciones estándar. Hemos realizado los experimentos de acuerdo con las pautas de ARRIVE. Todos los animales de experimentación fueron sacrificados mediante el método de dislocación cervical, que es uno de los métodos comunes de eutanasia.

Después de una semana de aclimatación, las ratas se dividieron aleatoriamente en grupos euglucémicos y diabéticos. A las ratas del grupo diabético se les inyectó una única dosis intraperitoneal de STZ (50 mg/kg de peso corporal) disuelta en solución salina fría para inducir la enfermedad33,34,35,36. La glucemia plasmática se examinó 10 días después de la inducción de la diabetes y las ratas se consideraron diabéticas sólo si su nivel de glucosa en sangre superaba los 17 mmol/l. Luego las ratas se mantuvieron en las condiciones especificadas durante 4 semanas. Posteriormente, las ratas diabéticas y euglucémicas se asignaron al azar en 5 grupos (6 ratas por grupo) como se describe a continuación. Grupo 1: Ratas de control normales: carboximetilcelulosa al 1 % (p/v) (Sigma-Aldrich, Malasia); Grupo 2: Ratas de control diabético-vehículo; Grupo 3: Diabéticos + Rutina (100 mg/kg14); Grupo 4: Diabéticos + Metformina (300 mg/kg37); Grupo 5: Diabético + Rutina (100 mg/kg) + Metformina (300 mg/kg); Todos los tratamientos se administraron una vez al día durante 4 semanas utilizando una aguja de sonda oral.

La sangre extraída de la arteria de la cola se colocó en vacutainers heparinizados, se centrifugó y el plasma separado se almacenó a -80 °C hasta su análisis. Los niveles totales de glucosa, colesterol y triglicéridos en sangre se evaluaron mediante un analizador Dimension Xpand Plus (Siemens, EE. UU.).

Al final del ensayo, las ratas fueron sacrificadas mediante dislocación cervical. Se extirpó la aorta torácica y abdominal descendente de varios tratamientos y de ratas del grupo control y se extrajeron la grasa y los tejidos conectivos adyacentes según el método descrito por Boutouyrie et al.38 Se tuvo el cuidado adecuado para preservar la integridad del endotelio. Los vasos no se estiraron ni se alteraron las superficies luminales de los anillos. Luego se cortó la aorta en pequeños anillos (de 3 a 5 mm de ancho) y se suspendió entre dos estribos de alambre en un baño de órganos con camisa que contenía 7 ml de solución fisiológica de Krebs normal (KPS), cuya composición es NaCl 118,2, KCl 4,7, CaCl2 · 2H2O. 2,5, KH2PO4 1,2, MgCl2 1,2, glucosa 11,7, NaHCO3 25,0 y EDTA 0,026 mM. La solución del baño se mantuvo a 37 °C y se oxigenó continuamente con una mezcla de 95% O2 y 5% CO2. Luego, los anillos se estiraron progresivamente hasta una tensión de precarga de 1,5 gy se dejaron equilibrar durante 45 min.

Durante este período, la solución del baño se reemplazó cada 15 min. Después del período de equilibrio, los anillos aórticos se expusieron tres veces (5 minutos cada uno) a 399 µl de una solución isotónica de cloruro de potasio 80 mM (alto KCl). Después del lavado de las respuestas al KCl alto, las respuestas de relajación a la ACh y SNP o las respuestas contráctiles a la PE se registraron en los anillos aórticos22 utilizando el sistema de registro Power Lab (AD Instruments, Australia).

Para acceder a la integridad del endotelio, las aortas se contrajeron previamente con una dosis de PE (10 µM) hasta que alcanzó un pico en 5 minutos, seguido de una dosis de ACh (10 µM) para relajar los anillos arteriales. Si la relajación inducida por ACh era superior al 50% del tono precontraído, se consideraba que el endotelio estaba funcionalmente intacto, mientras que se requería que los anillos del endotelio desnudo exhibieran menos del 5% de relajación a ACh22.

Las respuestas contráctiles de los anillos aórticos a concentraciones cada vez mayores de PE (1 nM a 1 µM) se registraron a intervalos de 4 min.

La relajación de ACh y SNP en aorta de rata se examinó en anillos aórticos precontraídos de PE. Los anillos se expusieron a una concentración única de PE (10 µM) y en el pico de la contracción se registraron las relajaciones hasta concentraciones cada vez mayores de ACh (1 nM a 1 µM) o SNP (1 nM a 1 µM) a intervalos de 4 minutos. .

Al final del tratamiento, se extrajeron el páncreas, el hígado y el riñón de los animales sacrificados y se almacenaron en formalina al 10% (v/v). Luego, los tejidos se procesaron, bloquearon, cortaron y mantuvieron en portaobjetos microscópicos para teñirlos con hematoxilina y eosina (HE). Se utilizó el microscopio Nikon ECLIPSE TS100 de 8,1 megapíxeles para capturar las fotomicrografías histológicas.

Todos los datos se expresaron como medias ± desviación estándar (DE). Las curvas de concentración-respuesta de los anillos aórticos a PE, ACh y SNP para cada condición experimental se trazaron utilizando un software de regresión no lineal (Prism versión 5.0 Graph pad software USA). Las respuestas observadas se analizaron para determinar su significancia estadística mediante el análisis de varianza unidireccional (ANOVA) para comparación de valores múltiples, seguido de una prueba post hoc apropiada (Tukeys) (Prism 2.0, GraphPad Software, EE. UU.). Se utilizaron los mismos métodos estadísticos para el cálculo de las diferencias estadísticas en los resultados de los análisis de plasma. Se consideró estadísticamente significativo un valor de p < 0,05.

Los conjuntos de datos generados y/o analizados durante el estudio actual están disponibles del autor correspondiente a solicitud razonable.

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